人皰疹病毒 8 型探針法熒光定量PCR試劑盒

產品名稱：人皰疹病毒 8 型探針法熒光定量PCR試劑盒

英文名稱：Human Herpesvirus-8(HHV-8) Probe qPCR Kit

人皰疹病毒 8 型（Human Herpesvirus-8，HHV-8) 會引起人類的原發和繼發感染，原發感染在兒童中多見，水痘的出疹突發，常出現紅色皮疹或斑疹，  繼續發展為成串水皰、膿皰，最后結痂。病情一般較輕，但偶可并發間質性肺炎和感染后腦炎。該病毒對人體健康造成嚴重損害，因此快速檢測人皰疹病毒 8 型具有重要意義。本產品就是以探針法熒光定量 PCR 技術為基礎開發的專門檢測人皰疹病毒 8 型的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物和探針經過優化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據牛腺病毒（4-8 型）DNA 高度保守區設計，不會跟其他微生物的 DNA 發生交叉反應。

5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為 5 個數量級。

6. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。

7.本產品只能用于科研。

【試劑組成】

【自備試劑】樣品RNA。

【注意事項】

一、稀釋標準曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本  產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。

2.       用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同。

3.       在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.       換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.       換槍頭，在 4 號管中加入 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.       重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7.       如果有 N 個樣品待提取，最好設置 N+2 個提取，多出的是 PC（樣品制備陽

性對照）和 NC（樣品制備陰性對照）。可以取陽性對照的 1000 倍稀釋液10μL 再加上一定量的水，使總體積與待提取樣品的規定體積一致，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8.       用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數 DNA/提取試劑盒兼容。

三、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9.       如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.      在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設  置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好

后最后加）：

11.  蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 PCR：

四、數據處理

12.  如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品核酸濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13.  如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 41。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 39。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 41 則為陰性，如果小于或等于 39 則為陽性。如果在 39-41 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct值如果大于或等于 41 則為陰性，如果小于 41，則為陽性。