柯薩奇病毒A10型PCR檢測試劑盒

產品名稱：柯薩奇病毒A10型PCR檢測試劑盒

本試劑盒用于體外定性檢測人咽/拭子樣本中的柯薩奇病毒 A10 型核糖核酸（RNA）。

柯薩奇病毒 A10 型(Coxsackievirus A10，CA10) 為單股正鏈RNA 病毒，屬于人類腸道病毒 A 類。CA10 為人類感染性疾病的一種病原，能引起多種疾病，如手足口病、皰疹性咽峽炎和脫甲病等。近幾年爆發的手足口病中除了主要病原體 EV71 外，還有多種人類腸道病毒參與感染，CA10 為其常見的一種。本試劑盒采用實時熒光 RT-PCR 方法，對咽/拭子樣本中的 CA10 核酸進行定性檢測， 檢測結果僅供科研，不能單獨作為確診或排除病例的依據。

本試劑盒利用實時熒光 PCR 技術，以 CA10 基因組編碼區的高度保守區為靶區域，設計特異性引物及熒光探針，通過一步法RT-PCR 擴增對 CA10 RNA 進行定性檢測。另外，本試劑盒帶有內標物質，用于對核酸提取過程及 PCR 擴增過程的監控，可減少假陰性結果的出現。

【試劑組成】

注：不同批號試劑盒的以上成分不可以互換使用； 需自備的試劑：核酸提取/試劑。

陰陽性質控品說明：陽性質控品為含 CA10 目的序列的假病毒溶液，濃度為 1×105copies/mL；陰性質控品為生理鹽水。陰陽性質控品在實驗中均參與核酸提取。

【儲存條件及有效期】

試劑盒保存于-20±5℃，有效期 9 個月；

反復凍融次數不超過 7 次；試劑開瓶后，在 4℃儲存溫度條件下開瓶次數不超過 7 次；試劑在 4℃條件下連續保存不超過 14 天；試劑在 37℃條件下連續保存不超過 120h；運輸采用干冰保持低溫，運輸時間不應超過 3 天。

試劑盒生產日期及失效期見產品標簽。

【適用儀器】

ABI Prism 7300，ABI Prism 7500，Roche LightCycler480，DA7600。

【樣本要求】

1.  適用樣本類型：咽/拭子。

2.  樣本采集：

樣本采集對象為手足口病、皰疹性咽峽炎等患者或疑似患者，特別是發病所在地的社區或托幼機構的 5 歲以下的兒童。

采集病人發病 3 日內的咽/拭子樣本，用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側扁桃體部位，應避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有 3～5ml 保存液（維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥。臨床樣本在運輸和貯存過程中要避免反復凍融，如果不能確保-20℃的條件，應該在 0～8℃運輸和保存。樣本應冷凍運輸， 運輸時要附有必要的信息，如樣本編號、發病日期和樣本采集日期。

3.  樣本保存和運送：樣本可立即用于測試，也可保存于-20℃待測，保存期為 4 個月；長期保存，請置于-70℃。運送采用 0℃冰壺。

【使用方法】

1.  樣本處理和核酸提取（樣本處理區）

可采用本公司生產的核酸提取/或純化試劑（如離心柱法；磁珠法）。本試劑盒中的內標溶液參與提取過程，若提取試劑盒中無說明內標的使用方法，則可按照樣本體積：內標溶液體積=50:1 的比例在樣本中加入內標溶液后進行核酸提取。

本試劑盒中的陰性質控品和陽性質控品均需要提取，用于對環境進行監控和 PCR 檢測試劑的質控。

2.  PCR 試劑準備（試劑準備區）

2.1       大包裝規格試劑使用：

從試劑盒中取出 CA10 PCR 反應液 A、CA10 PCR 反應液 B，室溫融化后振蕩混勻，8,000rpm 離心數秒后使用。取 N 個（N＝待測樣本個數+陰性質控品+ CA10 陽性質控品）PCR 反應管，

CA10 單人份擴增體系配制如下表：

將各組分充分混合后進行短時離心，以使管壁上的液體全部離心至管底，之后將 20µL 擴增體系分裝到PCR 管中。

2.2        單管單人份規格試劑使用： 直接使用 CA10 PCR 反應管。

3.  加樣（樣本制備區）

往上述對應的CA10 反應管中分別加入提取后的待測樣本核酸、陰性質控品核酸、陽性質控品核酸各 5µL，蓋緊管蓋，8,000rpm 離心數秒后轉移至擴增檢測區。

4.  PCR 擴增（擴增檢測區）

4.1        將反應管放入儀器樣品槽內。

4.2      ABI Prism 7500 儀器設置（ABI Prism 7300 儀器設置參照此操作）

4.2.1 打開“Setup"窗口，按樣本對應順序設置陰性質控（NTC）、陽性質控以及未知樣本（Unknow），并在“Sample Name"一欄中設置樣本名稱；探針檢測模式設置為：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：NONE，Reporter Dye2：VIC ，Quencher Dye2：NONE， Passive Reference： NONE。

4.2.2  打開instrument窗口，設置循環條件如下： 50℃ 15分鐘，1個循環；

95℃ 15分鐘，1個循環；

94℃ 15秒→60℃ 45秒（收集熒光），45個循環。設置完成后，保存文件，運行程序。

4.3     LightCycler480儀器設置

4.3.1  打開軟件后，選擇“New Experiment"，設置檢測模式為“Multi Color Hydrolysis Probe/UPL Probe"，檢測通道為FAM， VIC。

4.3.2  設置循環條件：

4.3.3  選擇“Sample Editor"，設定樣品的名稱、類型，在“Standard Concentration"框中輸入標準品濃度，設置完成后，保存文件，運行程序。

4.4      DA7600 儀器設置

4.4.1 打開軟件后，在設置程序參數界面中，設置擴增程序和溫度設置，條件如下：

4.4.2  點擊樣本參數界面，按樣本對應順序設置陰性質控（NTC）、陽性質控以及未知樣本（UNK），并在“樣本名稱"一欄中設置樣本名稱；探針染料類型選擇：FAM 和HEX 。

4.4.3 設置完成后，保存文件，運行程序。

5.  結果分析(請參照各儀器使用說明書進行設置，以 ABI7500 儀器為例)

反應結束后自動保存結果，根據分析后圖像調節 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據實際情況自行

調整，Start 值可以在 3～15、End 值可設在 5～20，在 Log 圖譜窗口設置 Threshold 的 Value 值，使閾值線位于擴增曲線指數期, 陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analysis 自動獲得分析結果，在此基礎上，微調閾值線位置使所得標準曲線的R2 值最大即可在“Report"窗口讀取檢測結果。

6.  質量控制

6.1       陰性質控品：FAM 檢測通道無擴增曲線，VIC 檢測通道有擴增曲線且 Ct 值＜43。

6.2   陽性質控品：FAM 檢測通道有擴增曲線，且 Ct 值＜33；VIC 檢測通道有或無擴增曲線。以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行。

7.  結果判斷

7.1        內標結果判定：若樣品 VIC 通道 Ct＜43，則可判定該樣品內標陽性，若 VIC 通道無擴增曲線或 Ct≥43，則可判定該樣品內標陰性。

7.2        若檢測樣品 FAM 檢測通道無擴增曲線或 Ct≥43，且該樣品內標陽性，可判樣品為柯薩奇病毒 A10 型陰性，

7.3       若檢測樣品 FAM 檢測通道有擴增曲線且 Ct≤38，可判樣品為柯薩奇病毒 A10 型陽性，

7.4       若檢測樣品 FAM 檢測通道有擴增曲線且 38＜Ct＜43，該樣品建議復檢，若復檢結果 Ct＜43 則可判樣品為柯薩奇病毒 A10 型陽性；若復檢結果無擴增曲線或 Ct≥43，可判樣品為柯薩奇病毒 A10 型陰性。

【陽性判斷值或者參考區間】

通過臨床樣本檢測結果分析，利用 ROC 曲線法最終確定本試劑盒的參考區間為 38～43；內標參考值為 43。

【檢驗結果的解釋】

1. FAM 檢測通道為陽性時，由于體系的競爭關系，內標可能為陰性。

2. 內標結果為陰性時，若該檢測管的 FAM 檢測通道也為陰性，說明體系受抑制或操作失誤，試驗無效，需對該樣品進行復檢。

3. 每次實驗均需檢測陰性質控品及陽性質控品結果滿足質量控制要求時方可進行檢測結果的判定；

【檢測方法的局限性】

1. 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送及保存質量有關；

2. 樣本處理時沒有控制好交叉污染，可能出現假陽性結果；

3. 病毒在流行過程中的基因突變則也可能導致假陰性結果；

4. 由于不同提取方法的原理不同，采用不同核酸提取/試劑進行樣本處理時的核酸提取效率存在一定差異，請使用本產品說明書中檢驗方法所選用的核酸提取/試劑；

5. 本檢測結果僅供臨床參考，如需確診病例請結合臨床癥狀及其他檢測手段。

【產品性能指標】

1  試劑盒分析性能評估結果顯示：

1.1        陰陽性參考品符合率：5 份陽性參考品符合率為 100％；10 份陰性參考品符合率為 100％。

1.2        Z低檢測限：8.0×102copies/ml。

1.3        精密度：批內、批間精密度檢測 Ct 值的變異系數（CV）均小于 5%。

1.4        分析特異性

1.4.1                     交叉反應：交叉反應驗證的柯薩奇病毒 A6 型、柯薩奇病毒 B 組、脊髓灰質炎病毒、腸道病毒 70 型、腸道病毒 71 型、柯薩奇病毒 A24v、埃可病毒 11 型、埃可病毒 30 型、麻疹病毒、風疹病毒、副流感病毒、腺病毒、腮腺炎病毒、鏈球菌、葡萄球菌、肺炎鏈球菌均為來源于臨床的滅活病毒培養物或者細菌培養液，并經 PCR 或測序確認為相應病原體，在本試劑盒的檢測條件下，病原體濃度不高于 1.0×105copies/mL 時，檢測結果均為陰性，無交叉反應。

1.4.2                     干擾反應：咽/拭子樣本可能存在的內源性物質以及可能存在的外源性藥物紅霉/素（60mg/L）、頭孢/克洛（75mg/L）、地塞/米松（0.6mg/L）、利巴/韋林（2mg/L)、干擾素（100 單位/ml）均不影響試劑盒的檢測結果。

2  臨床試驗：與對照方法檢測結果對比，本試劑盒檢測結果的靈敏度為 100%、特異度為 98.0%、總符合率 98.4%，Kappa 值為 0.952

（p<0.001）。

【注意事項】

1.  本產品僅用于體外檢測，實驗前請仔細閱讀本說明書；

2.為了避免樣本中任何潛在的生物危險，檢測樣本應視為具有傳染性物質，避免接觸到皮膚和粘膜；樣本的處理應在可防止氣霧外流的生物安全柜中操作，樣本制備區所用過的試管、吸頭需打入盛有消毒劑的容器，并與廢棄物一起滅菌后方可丟棄；樣本操作和處理均需符合相關法規要求：包括衛生部《微生物生物醫學實驗室生物安全通用準則》和《醫療廢物管理條例》；

3.  產物處理：PCR 結束之后，產物容易引起污染，應由當天不再參與實驗的人員將所有反應管放入生物安全垃圾處理袋或其他容器中確認WAN全封閉后方可丟棄；

4.  全程應避免RNA 酶污染，實驗過程中穿工作服，佩戴一次性手套和口罩。在潔凈消毒、紫外光殺菌的化學通風櫥或生物安全柜完成操作，避免有害物質進入呼吸道；

5.  使用經高壓滅菌的一次性離心管和吸頭或購買無DNA 酶、RNA 酶的離心管和吸頭；

6.  PCR 檢測試劑使用前要WAN全解凍，8,000rpm 離心數秒后使用，但應避免反復凍融；

7.  如果在樣本處理中沒有控制好交叉污染，可能出現假陽性；

實驗室管理應嚴格按照PCR 基因擴增實驗室的管理規范，實驗人員必須進行專業培訓，實驗過程嚴格分區進行（試劑準備區、樣本制備區、擴增檢測區），所用消耗品應滅菌后一次性使用，實驗操作的每個階段使用專用的儀器和設備，各區各階段用品不能交叉使用；

1.  實驗完畢用 10%次氯酸或 75%酒精處理工作臺和移液器，然后用紫外線燈照射 20-30 分鐘； 10.完成樣本核酸提取后，建議馬上進行下一步實驗，否則請保存于-20℃待用(24h 內)；

11. 所用消耗品應滅菌后一次性使用，實驗操作的每個階段使用專用的儀器和設備，各區各階段用品不能交叉使用；

12. 須對每次實驗進行質量控制。