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產品簡介
副流感病毒通用探針法熒光定量RT-PCR試劑盒艱難梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile)屬厭氧性細菌，一般寄生在人的腸道內。
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副流感病毒通用探針法熒光定量RT-PCR試劑盒
商品名稱：副流感病毒通用探針法熒光定量RT-PCR試劑盒
副流感病毒是常常引起兒童下呼吸道感染的一種病毒，其致病性僅次于呼吸道合胞病毒 (RSV)。與RSV一樣，人類副流感病毒可以造成反復發作的上呼吸道感染（如感冒和喉嚨痛）。它也能造成嚴重的反復感染的下呼吸道疾病（如肺 炎，支氣管炎和細支氣管炎），特別是在老年人中和有免疫缺陷人群中。因此快速靈敏診斷具有重要意義。本產品就是以探針法熒光定量 RT-PCR 技術為基礎開發的專門檢測副流感病毒的試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。
2. 引物和探針經過優化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據副流感病毒高度保守區設計，不會跟其他病毒的 RNA 發生交叉反應。
5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應。
6. 本產品只能用于科研。
【試劑組成】
成分 | 包裝 |
2×Probe qPCR MagicMix | 500μL（本色蓋） |
熒光 PCR 專用模板稀釋液 | 1 mL（黃蓋） |
副流感病毒通用探針法 qRT-PCR 引物混合液 | 100 μL（白蓋） |
副流感病毒通用 qRT-PCR 探針 | 50 μL（棕色管） |
副流感病毒通用探針法 qRT-PCR 陽性對照(1×10E8 拷貝/μL) | 50 μL（黃蓋） |
核酸釋釋劑（試用裝） | 20 次（1mL,綠蓋） |
使用手冊 | 1 份 |
【儲存條件及有效期】
低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
【自備試劑】樣品 DNA。
【使用方法】
一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。
1. 由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原， 本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震
蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 RNA 的制備
7. 如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性
對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒 RNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒 RNAout。本試劑盒免費贈送 20 次免 RNA 提取的核酸釋放劑試用裝，該釋放劑的裂解液可以直接作為RT-PCR 模板， 省略了 RNA 提取步驟。其使用手冊可向本公司客服索取。
三、Probe qRT-PCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設
置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好 后最后加）：
成分 | 樣品管N+2 個 | RT-PCR 陰性對照 管 | 標準曲線樣品管 （2-7 管） |
2×Probe qPCR MagicMix | 各 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
副流感病毒通用 qRT-PCR 探針 | 各 1 μL | 1 μL | 各 2 μL |
副流感病毒通用探針法qRT-PCR 引物混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
待測樣品 RNA 模板 | 各 6 μL | - | - |
超純水 | - | 6 μL | - |
第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液 （2-7 號） |
- |
- | 各 6μL（2 號樣到 2 號管，3 號樣到 3 號 管…） |
11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 RT-PCR：
過程 | 溫度 | 時間 |
逆轉錄 | 50℃ | 30 min |
預變性 | 95℃ | 10 min |
RT-PCR 反應 （40 個循環） | 95℃ | 15 sec |
60℃ | 1 min（采集 FAM 通道的熒光 信號） |
五、數據處理
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。
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