森林腦炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

商品名稱：森林腦炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Name     ：Forest Encephalitis Virus(SFV) SYBR qRT-PCR Kit

林腦炎病毒(Forest Encephalitis Virus，SFV)是一種RNA病毒，由蜱傳播，在春夏季節流行于俄羅斯及我國東北森林地帶，非疫區易感人被帶病毒的蜱叮咬后，易感染發病，另外因喝生羊奶（羊感染時奶中帶病毒或被蜱類污染）而被傳染，約經8～14天潛伏期后發生腦炎，出現肌肉麻痹、wei縮、昏迷致死，少數痊yu者也常遺留肌肉麻痹。居住在森林疫區的發生腦炎，出現肌肉麻痹、wei縮、昏迷致死，少數痊yu者也常遺留肌肉麻痹。居住在森林疫區的人，因受少量病毒的隱性感染，血中有中和抗體，對病毒有免疫力，因此森林腦炎病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用。本產品基于PCR原理開發。它具有下列特點：

1.       一站式，用于不需要單獨準備每種成分，包括引物和對照。

2.      根據森林腦炎病毒的保守基因序列設計的引物，具有良好的特異性。

3.      基于染料法qRT-PCR檢測，靈敏度比常規RT-PCR高10-100倍，可以達到至少1000拷貝/反應。

4.      使用一管式qRT-PCR技術，RT和PCR兩步在一個試管內完成，不需要中間轉移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。

5.      本產品足夠50次30μL體系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于臨床。

【試劑組成】

【儲存條件及有效期】

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為12個月。陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置。本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供RNA片段作為陽性對照。

【自備試劑】樣品RNA

【使用方法】

一、稀釋陽性對照（以10E2-10E7這6個10倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原。

1.       標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

2.      在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

3.      換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

4.      換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品RNA的制備

5.      如果有N個樣品，必須設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第4號（濃度為1×10E4拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）。可以用水作為制備的陰性對照。

       6.      用自選方法純化N+2個樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒RNA提取試劑盒兼容。

三、設置RT-PCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）

7.       如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（用第4號陽性對照稀釋液做模板）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把6個標曲反應縮減成1個，其余不變。

8.      在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加）：

注:需使用ROX染料I的機型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。需使用ROX染料II的機型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。不需要使用ROX的機型：Thermal Cycle Dice Real Time System， LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。

9.       上機后按下面參數進行RT-PCR（參數可能會因儀器不同而需優化）。

11.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。