【產品名稱】

商品名稱：新城疫中強毒株（NDV-M）核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)

Name：Newcast Deaseace Virus Mesogenic and Virulent Strains Detection Kit (Real-Time RT-PCR Method)

【包裝規格】25T/盒、50T/盒

【預期用途】

新城疫是由新城疫病毒(New castle disease viurs, NDV)引起的一種禽類急性、高度接觸性傳染病。ND 常呈敗血癥經過,以呼吸困難、神經機能紊亂、粘模和漿膜出血等為主要特征[1]。根據病毒株致病力的差異，將 NDV 分為強毒力型、中等毒力型及弱毒力型。NDV 中強毒株在雞群中傳播迅速，危害嚴重；而弱毒株僅引起雞群呼吸道感染和產蛋量下降，多與其它疾病共同發病而造成一定的危害[1-3]。

本試劑盒適用于檢測的禽類動物肺、脾、腦等組織、呼吸道分泌物、全血等標本中新城疫中強毒株，適用于新城疫中強毒感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒對新城疫中強毒 F 基因裂解位點設計特異性引物和探針[1-2]，用一步法熒光 RT-PCR 技術對新城疫中強毒進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染病料的病原學診斷。

【試劑組成】

包裝規格25T/盒50T/盒

NDV-M 反應液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

NDV-M 陽性質控品50μL ×1 管50μL ×1 管

陰性質控品250μL ×1 管250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

病死或撲殺禽，取肺、脾、腦等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物，放于 1mL50%甘油生理鹽水中；用注射器取血 5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管。

【保存和運輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h；若需長期保存，應放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區）

1.1樣本前處理

每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；棉拭子直接取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；全血樣品待血凝后取血清 100μL，置于 1.5mL 離心管中。

1.2核酸提取

推薦采用優利科（上海）生命科學有限公司生產的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取， 請按照試劑說明書進行操作。

2.試劑配制（試劑準備區）

根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿

7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

試劑NDV-M 反應液酶液

用量19μL1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，20μL /管。

3.加樣（樣本處理區）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。

4.PCR 擴增（核酸擴增區）

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；

4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；熒光通道選擇：檢測通道（ReporterDye）FAM，淬滅通道

（QuencherDye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環參數設置：

步驟循環數溫度時間收集熒光信號

11 cycle50℃10min否

21 cycle95℃2min否

345 cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.結果分析判定

5.1結果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應結束后自動保存結果，根據分析后圖像調節 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據實際情況自行調整，Start 值可設在 3～15、End 值可設在 5～20，使閾值線位于擴增曲線指數期，陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結果。

5.2結果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數增長曲線； 陰性：樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

5.3質控標準

陰性質控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質控品：擴增曲線有明顯指數增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；

3.陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；

6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；

7.本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行；

2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應液應避光保存；

4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。

【參考文獻】

[1]曹軍平,胡新崗,吳雙,等.熒光定量 RT-PCR 檢測中、強毒力新城疫病毒方法的建立及驗證.中國動物檢疫,2012. [2]遼寧質量監督局.DB21/T2465-2015 新城疫強弱毒株 RT-PCR 鑒別診斷技術[S].

[3] Kant A G, Koch D J. Differentiation of virulent and non-virulent strains of NDV within 24 hours by PCR [J].AvianPathol,1997,26:837-849.