蛋白質羰基含量測定試劑盒

 微量法100T/48S

注   意 ：正式實驗之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

蛋白質羰基是多種氨基酸在蛋白質的氧化修飾過程中的早期標志，其含量高低表明蛋白質氧化損傷程度的大小，是衡量蛋白質氧化損傷的主要指標。

測定原理：

羰基與2,4-er硝基苯肼反應生成紅色2,4-er硝基苯腙，在370nm處有特征吸收峰。

自備實驗用品及儀器：

天平、恒溫水浴鍋、低溫離心機、漩渦震蕩儀、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水、無水乙醇、乙酸乙酯。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑0.1g×5支，4℃避光保存。（使用前根據樣品數，每支加1mL水溶解，每支為10個樣品用量）

試劑二：液體6mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體6mL×1瓶，4℃保存。

試劑四：液體15mL×1瓶，4℃保存。

試劑五：根據測定樣品量，將乙酸乙酯和無水乙醇等體積混合。

試劑六：液體60mL×1瓶，4℃保存。

樣品處理：

1.        組織樣品：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，于4℃，4000g離心10min，取上清，加入0.1mL試劑一，室溫放置10min，4℃，10000g離心10min，取上清待測。

2.        細菌、真菌：按照細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

3.        血清等液體樣本：直接測定。

測定步驟和操作表：

1、   分光光度計/酶標儀預熱30min，調節波長至370nm。

2、   操作表

計算公式：

a．用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1.        按照樣本蛋白濃度計算

蛋白質羰基含量（μmol/mg prot）= [ΔA₃₇₀×V反總÷（ε×d）]÷(V樣×Cpr) =0.227×ΔA₃₇₀÷Cpr

2.        按照樣本重量計算

蛋白質羰基含量（μmol/g 鮮重）= [ΔA₃₇₀×V反總÷（ε×d）]÷(W ×V樣÷V樣總) =0.227×ΔA₃₇₀÷W

3. 按照細胞數量計算

蛋白質羰基含量（μmol/10⁴cell）= [ΔA₃₇₀×V反總÷（ε×d）]÷(細胞數量 ×V樣÷V樣總) =0.227×ΔA₃₇₀÷細胞數量

4.        按照液體體積計算

蛋白質羰基含量（μmol/mL）= [ΔA₃₇₀×V反總÷（ε×d）]÷V樣=0.227×ΔA₃₇₀

V反總：反應體系總體積，0.3 mL；ε：羰基毫摩爾消光系數，22 L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.06 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL，W：樣本質量，g

b．用96孔板測定的計算公式如下

1. 按照樣本蛋白濃度計算

蛋白質羰基含量（μmol/mg prot）= [ΔA₃₇₀×V反總÷（ε×d）]÷(V樣×Cpr) =0.454×ΔA₃₇₀÷Cpr

2. 按照樣本重量計算

蛋白質羰基含量（μmol/g 鮮重）= [ΔA₃₇₀×V反總÷（ε×d）]÷(W ×V樣÷V樣總) =0.454×ΔA₃₇₀÷W

3. 按照細胞數量計算

蛋白質羰基含量（μmol/10⁴cell）= [ΔA₃₇₀×V反總÷（ε×d）]÷(細胞數量 ×V樣÷V樣總) =0.454×ΔA₃₇₀÷細胞數量

4. 按照液體體積計算

蛋白質羰基含量（μmol/mL）= [ΔA₃₇₀×V反總÷（ε×d）]÷V樣=0.454×ΔA₃₇₀

V反總：反應體系總體積，0.3 mL；ε：羰基毫摩爾消光系數，22 L/mmol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.06 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL，W：樣本質量，g

注意事項：

1. 試劑一使用前根據要測定的樣品數現配，配置好后4℃保存，若變為黑色，則不能使用。

2. 試劑二見光易分解，反應需嚴格避光。