超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）試劑盒說(shuō)明書(shū)（WST-8 法）

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　微量法 100 管/96 樣

注　意：正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

SOD（EC 1.15.1.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用，生成 H2O2 和 O2。SOD 不僅是超氧化物陰離子清除酶，也是 H2O2 主要生成酶，在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用。

測(cè)定原理：

通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子(O2-)，O2-可與 WST-8 反應(yīng)產(chǎn)生水溶性染料甲臜，后者在 450nm 處有吸收；SOD 可清除 O2-，從而抑制了甲臜的形成；反應(yīng)液黃色越深，說(shuō)明 SOD 活性愈低，反之活性越高。

需自備的儀器和用品：

酶標(biāo)儀、離心機(jī)、移液器、96 孔板、研缽、冰和蒸餾水

試劑的組成和配制：

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 20mL×1 瓶，4℃避光保存；

試劑二：液體 150μL×1 支，4℃避光保存；

試劑三：液體 100μL×1 支，4℃保存；

試劑四：粉劑×2 瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 450nm。

2、 試劑三的稀釋：將試劑三用蒸餾水稀釋 50 倍，用多少配多少。（試劑三和蒸餾水 1：49稀釋。

3、 工作液配制：在試劑一加入 100μL 試劑二，充分混勻。配好的試劑 4℃避光可保存一周。（若一次性測(cè)定樣本較少，可按照實(shí)際用量將試劑一和試劑二按照 20mL：0.1mL 的比例混勻配制）

4、 將一瓶試劑四用 5mL 蒸餾水溶解（溶解后一周內(nèi)用完）。

5、 樣本測(cè)定（在 96 孔板中依次加入下列試劑）

充分混勻，室溫靜置 30min 后，450nm 處測(cè)定各管吸光值 A。

注意事項(xiàng)：

1、試劑三為酶，不可冷凍，使用時(shí)在冰上放置。

2、對(duì)照管只需要做一管。

3、SOD 為什么有的樣本測(cè)定管大于對(duì)照管，對(duì)照管數(shù)值在什么范圍？

對(duì)照管的范圍是 0.4-1。對(duì)照管吸光值過(guò)低可能是（1）試劑三活性低，可以適當(dāng)減少稀釋倍數(shù)；（2)沒(méi)有按順序加試劑；（3）反應(yīng)時(shí)間不夠，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（反應(yīng)時(shí)間 30min可以延長(zhǎng)到 40min）。對(duì)照管吸光值過(guò)高可能是試劑三未按操作說(shuō)明書(shū)稀釋相應(yīng)倍數(shù)。若出現(xiàn)測(cè)定管大于對(duì)照管，可能是樣本中雜質(zhì)的影響太大，為了降低雜質(zhì)的影響一般將樣本提取上清液用蒸餾水或提取液稀釋 10 倍后再測(cè)，通常可以使測(cè)定正常。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

SOD 活性計(jì)算：

1、抑制百分率的計(jì)算

抑制百分率＝(A 對(duì)照管－A 測(cè)定管) ÷A 對(duì)照管× 100%

盡量使樣本的抑制百分率在 10-90%范圍內(nèi)。如果計(jì)算出來(lái)的抑制百分率小于 10%或大于90%，則通常需要調(diào)整加樣量后重新測(cè)定。如果測(cè)定出來(lái)的抑制百分率偏高，則需將樣本用提取液適當(dāng)稀釋；如果測(cè)定出來(lái)的抑制百分率偏低，則需重新準(zhǔn)備濃度比較高的待測(cè)樣本。

2、SOD 酶活性單位：

3、在上述黃嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為 50%時(shí)，反應(yīng)體系中的 SOD 酶活力定義為一個(gè)酶活力單位(U/mL)。

3、SOD 酶活性計(jì)算：

（1）血清（漿）SOD 活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷V 樣=20×抑制百分率÷(1－抑制百分率)

（2）組織、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞 SOD 活力計(jì)算：

a.按樣本蛋白濃度計(jì)算

SOD 活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷(V 樣×Cpr)

=20×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷Cpr需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

b.按樣本鮮重計(jì)算

SOD 活性(U/g 鮮重)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷(W ×V 樣÷V 樣總) =20×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷W

c.按細(xì)菌或細(xì)胞個(gè)數(shù)計(jì)算

SOD 活力(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率) ×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)

=0.04×抑制百分率÷(1－抑制百分率)

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；

V 樣總：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL ；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。