木質素過氧化物酶（Lignin peroxidase，Lip）試劑盒說明書

         微量法100T/96S

注   意 ：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

木質素過氧化物酶（EC1.11.1.14）是一種含亞鐵血紅素的過氧化物酶，屬于木質素降解酶系，在木質素生物降解、造紙工業、紡織工業、芳香化合物轉化與降解及環境污染控制等方面具有較大的應用潛力。

測定原理：

木質素過氧化物酶催化天青脫甲基，在651nm處測定吸光值減少。

自備實驗用品及儀器：

天平、研缽、低溫離心機、酶標儀、96孔板、可調式移液器、冰。

試劑組成和配制： 

試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入115mL蒸餾水，充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存一個月。

試劑二：液體5mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體5mL×1支，4℃保存。

酶液提取：

1.        組織：按照質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL試劑一）加入試劑一，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測。

2.        細胞：按照細胞數量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測。

3.        培養液或其它液體：直接檢測。                        

測定操作：

1、酶標儀預熱30min以上，調節波長至651nm。

2、臨用前按每個樣本試劑一：試劑二：試劑三=80:40:40（μL）的比例配制工作液，現配現用。

3、在96孔板中依次加入如下試劑

酶活計算公式：

1．按照蛋白濃度計算

酶活性定義：每mg組織蛋白在每mL反應體系中每分鐘A651變化0.01為一個酶活力單位。

LiP活性（U/mg prot）= ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T =250×ΔA÷Cpr

2．按照樣本質量計算

酶活性定義：每g組織在每mL反應體系中每分鐘A651變化0.01為一個酶活力單位。

LiP活性（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =250×ΔA÷W

3．按照細胞數量計算

酶活性定義：每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中每分鐘A651變化0.01為一個酶活力單位。

LiP活性（U/104 cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T=0.5×ΔA

4．按照液體體積計算

酶活性定義：每mL血清（漿）在每mL反應體系中每分鐘A651變化0.01為一個酶活力單位。

LiP活性（U/mL）=ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T =250×ΔA

V反總：反應總體積，0.2mL；V樣：反應中樣本體積，0.04mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，2min