焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉移酶（Pyrophosphate: fructose-6 – phosphate-1-phosphoric acid transferase，PFP）試劑盒說明書

                                                  微量法100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉移酶（PFP，EC2.7.1.90）是一種胞質酶，廣泛存在于植物組織中，催化果糖-6-磷酸與果糖-1,6-二磷酸之間的可逆轉化，在光合作用碳代謝中起重要作用。

測定原理：

PFP催化6-磷酸果糖轉化為1,6-二磷酸果糖，它在醛縮酶和磷酸丙糖異構酶的作用下轉變為3-磷酸甘油醛，再由3-磷酸甘油醛脫氫酶和NADH催化生成3-磷酸甘油酸、NAD和磷酸，340nm處的吸光度變化反映了PFP的活性的高低。

自備實驗用品及儀器：

天平、低溫離心機、研缽、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑四：液體1mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑五：液體1mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑六：液體2mL×1瓶，4℃避光保存。

酶液提取：

1.        組織：按照質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置冰上待測。

2.        細胞：按照細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置冰上待測。

3.        液體：直接檢測。

測定操作：

1.        紫外分光光度計/酶標儀預熱30min，調節波長至340nm，蒸餾水調零。

2.        取微量石英比色皿/96孔板，依次加入100μL試劑一，20μL試劑二，20μL試劑三，10μL試劑四，10μL

試劑五，20μL試劑六，20μL粗酶液，充分混勻，記錄340nm處10s的吸光值A1和310s的吸光值A2，△A=A1-A2

計算公式：

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PFP（nmol/min /mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PFP（nmol/min /g 鮮重）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

（3）按照細胞數量計算

酶活單位定義：每104個細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PFP（nmol/min/104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×細胞數量÷V樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷細胞數量

（4）按照液體體積計算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PFP（nmol/min/mL）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T=321.54×ΔA

V反總：反應體系總體積，0.2mL；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g

b.使用96孔板測定的計算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PFP（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T= 643.08×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PFP（nmol/min /g 鮮重）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T= 643.08×ΔA÷W

（3）按照細胞數量計算

酶活單位定義：每104個細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PFP（nmol/min /104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×細胞數量÷V樣總) ÷T

= 643.08×ΔA÷細胞數量

（4）按照液體體積計算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PFP（nmol/min /mL）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T= 643.08×ΔA

V反總：反應體系總體積，0.2mL；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g