二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                   微量法100管/96樣

注    意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

二磷酸核酮糖羧化酶（EC 4.1.1.39）是植物光合作用中的一個(gè)關(guān)鍵酶，既控制著CO2的固定，同時(shí)又制約著碳素向Calvin循環(huán)和光呼吸循環(huán)分流，其活性的大小直接影響著光合速率。

測(cè)定原理：

在Rubisco的催化下，1分子的核酮糖-1，5-二磷酸（RuBP）與1分子的CO2結(jié)合，產(chǎn)生2分子的3-磷酸甘油酸（PGA），PGA可通過(guò)外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用，產(chǎn)生甘油醛-3-磷酸，并使還原型輔酶I（NADH）氧化。因此，340nm吸光度的變化可計(jì)算還原型輔酶I氧化速率，還原型輔酶I氧化速率可反應(yīng)Rubisco的活性。

需自備的儀器和用品：

分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

提取液二：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：25mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入10mL試劑一，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入10mL試劑一，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑四：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入1 mL試劑一，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

（注意：試劑二、三、四溶解后，按需分裝-20℃保存。）

粗酶液制備：

①總Rubisco酶提取：建議稱(chēng)取約0.1g樣本，加入1mL提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時(shí)間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測(cè)定。

②胞漿和葉綠體Rubisco酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5～10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g樣本，加入1mL提取液一），冰浴勻漿后于4℃，200g離心5min，棄沉淀，取上清在4℃，8000g離心10min，取上清用于測(cè)定胞漿Rubisco酶活性，取沉淀加1mL提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時(shí)間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測(cè)定葉綠體中Rubisco酶活性。

建議測(cè)定總Rubisco酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的Rubisco，則按照步驟②提取粗酶液。

（注意：粗酶液制備過(guò)程中超聲破碎操作使用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行。）

測(cè)定步驟：

1、   分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測(cè)定

（1）         工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三1：1混合，用多少配多少；

（2）         在微量石英比色皿或96孔板中加入10uL樣本、10uL試劑四和180uL工作液，混勻，立即記錄340nm處20s時(shí)吸光值A(chǔ)1和5min20s時(shí)的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

Rubisco活性計(jì)算：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：25℃中1 mg蛋白1 min氧化1 nmol NADH。

 Rubisco（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T =643×ΔA÷Cpr

此法需要測(cè)定粗酶液中蛋白質(zhì)濃度，建議選購(gòu)本公司生產(chǎn)的BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒。

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：25℃中1 g組織1 min氧化1nmol NADH。

 Rubisco（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W

上述計(jì)算公式中各符合含義：

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5min；W：樣本質(zhì)量，g。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：25℃中1 mg蛋白1 min氧化1 nmol NADH。

 Rubisco（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T =1286×ΔA÷Cpr

此法需要測(cè)定粗酶液中蛋白質(zhì)濃度，建議選購(gòu)本公司生產(chǎn)的BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒。

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：25℃中1 g組織1 min氧化1nmol NADH。

 Rubisco（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

上述計(jì)算公式中各符合含義：

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；W：樣本質(zhì)量，g。