小鼠骨髓基質細胞

（OP9）

細胞介紹

OP9細胞株源自新生的op/op 小鼠顱蓋。因編碼M-CSF的基因中的一個突變，它不能生成有功能的巨噬細胞克隆刺激因子(M-CSF)。M-CSF的存在對胚胎干細胞(ES)分化成血細胞而不是其他巨噬細胞有抑制功能。 OP9細胞可以用于與小鼠胚胎干細胞共培養以誘導胚胎干細胞分化成成紅血球來源的、骨髓來源的和B細胞譜系的血細胞。與OP9共培養不需要外源的生長因子或復雜的胚胎結構。這個系統對研究造血細胞的發育和分化的分子機理有用。

細胞特性

1）  來源：小鼠骨髓，基質

2）  形態：成纖維細胞，貼壁生長

3）  含量：>1x106  細胞數

4）  規格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)  用途：僅供科研使用。

運輸和保存：干冰運輸及復蘇好存活細胞：（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇，若發現干冰已揮發干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯系。（2）T25瓶復蘇的存活細胞常溫發貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。

細胞接收后的處理：

1）收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養箱放置約2-3h，若發現培養瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯系我們。

2）請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀態，同時給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細胞狀態的依據。

3）貼壁細胞：細胞在37℃培養箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下，可去除培養瓶中灌液培養基（若有未貼壁的細胞需要離心回收，重懸打入到原培養瓶中）,加入新配制的完培6-8mL，放到細胞培養箱中繼續培養。若細胞生長密度達70%-80%以上，可以對細胞進行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收。

4）備注：運輸用的培養基（灌液培養基）不能再用來培養細胞，請換用按照說明書細胞培養條件新配制的完培來培養細胞。  收到細胞后第一次傳代建議T25培養瓶1：2傳代 。

一．培養基及培養凍存條件準備：

1） 準備MEM-a培養基；優質胎牛血清，20%；雙抗，1%。

2） 培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。

二．細胞處理：

1）  凍存細胞的復蘇：：

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完培的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完培重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完培的培養瓶（或皿）中37℃培養過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

2）  細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法：

1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養基來終止消化。

3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完培以保持細胞的生長活力，后續傳代根據實際情況按1:2~1:5的比例進行。

3）細胞凍存: 收到細胞后建議在培養前3代時凍存一批細胞種子以備后續實驗使用。下面T25瓶為例；

1. 細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數板計數，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個活細胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞 ，按每1ml凍存液含1×106~1×107個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數、日期等信息。

3. 將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續查閱和使用。

注意事項：

1. 所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2. 建議在復蘇凍存細胞時始終使用防護手套、衣服和戴上防護面罩。注意：凍存管浸沒在液氮中會泄漏，并會慢慢充滿液氮。解凍時，液氮轉化成氣相可能導致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子，從而產生飛揚的碎屑造成人員傷害。