4-香豆酸：輔酶 A 連接酶（ 4-coumarate:CoA ligase，4CL)

試劑盒說明書

微量法 100 管/48 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

4CL 是連接苯丙酸途徑與木質素特異合成途徑的關鍵酶，主要催化肉桂酸生成相應的肉桂酸輔酶 A 酯，是合成木質素與其他苯丙烷類化合物的代謝流向調控點。該酶主要存在于高等植物、酵母和菌類中，研究該酶可以探討多種生物細胞發育過程中木質素沉積的代謝機理， 為減少水果石細胞含量而提高其品質提供依據。

測定原理：

4CL 催化 4-香豆酸和 CoA 生成 4-香豆酸 CoA，在 333nm 下測 4-香豆酸 CoA 生成速率，即可反映 4CL 活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1  瓶，4℃保存；

試劑一：液體 25 mL×1 瓶， 4℃保存； 試劑二：粉劑×2 瓶，-20℃保存；

粗酶液提取：

細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量

（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、 分光光度計或酶標儀 40℃預熱 30min 以上，調節波長至 333nm，蒸餾水調零。

2、 準備 96 孔 UV 板一塊（非普通酶標板，普通酶標板只能透過可見光，不能透過紫外光， 檢測波長小于 340nm 務必使用 UV 板）。

3、 樣本測定

（1）   在試劑二中加入 5mL 試劑一充分溶解混勻，置于 40℃水浴預熱 10min；現配現用（ 配好后 24h 內用完）；

（2）   對照管：在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入 10μL 樣本和 190μL 試劑一，混勻，立即記錄 333nm 處 40℃反應 30min 后的吸光值A1。

（3）   測定管：在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入 10μL 樣本和 190μL 試劑二，混勻，立即記錄 333nm 處 40℃反應 30min 后的吸光值 A2，計算 ΔA=A2-A1。每個測定管設一個對照管。

4CL 活性計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol4-香豆酸輔酶A 定義為一個酶活力單位。

4CL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10 9]÷(V 樣×Cpr) ÷T= 31.75×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸輔酶A 定義為一個酶活力單位。

4CL（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10 9]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T= 31.75×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸輔酶A 定義為一個酶活力單位。

4CL（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10 9]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T= 0.063×ΔA

V 反總：反應體系總體積，2×10 -4 L；ε：4-香豆酸輔酶 A 摩爾消光系數，2.1×10 4 L / mol /cm；

d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；

T：反應時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。

b. 用 96 孔板測定的計算公式如下

1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的 4-香豆酸輔酶A 定義為一個酶活力單位。

4CL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10 9]÷(V 樣×Cpr) ÷T= 63.49×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸輔酶A 定義為一個酶活力單位。

4CL（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10 9]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T= 63.49×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸輔酶A 定義為一個酶活力單位。

4CL（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10 9]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T= 0.127×ΔA

V 反總：反應體系總體積，2×10 -4 L；ε：4-香豆酸輔酶 A 摩爾消光系數，2.1×10 4 L / mol /cm；

d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；

T：反應時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。