甲基檸檬酸合酶（metheyl-citrate synthase，MCS）試劑盒說明書

                                         微量法100管/96樣

注   意 ：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：                           

MCS廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞的線粒體基質中，與檸檬酸合酶（CS）共同參與三羧酸循環的調節。

測定原理：

MCS催化丙酰CoA和草酰乙酸產生甲基檸檬酰輔酶A，進一步水解產生甲基檸檬酸；該反應促使無色的DTNB轉變成黃色的TNB，在 412nm處有特征吸光值。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水

試劑組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：液體20mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：液體1.5mL×1支，-20℃保存；

試劑四：液體30mL×1瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存；

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存，臨用前加入1mL蒸餾水，用不完的試劑仍-20℃保存；

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

①        稱取約0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

②        將勻漿600g，4℃離心5min。

③        棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

④        上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的CS（此步可選做）。

⑤        在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復30次），用于線粒體CS測定。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長至412nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定

（1）在試劑五中加入1mL無水乙醇和22mL試劑四，混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、220μL試劑五和10μL試劑六，混勻，記錄412nm處20秒時的初始吸光度A1和2分20秒時的吸光度A2，計算ΔA=A2-A1。

MCS活性計算：

a.        使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

MCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

MCS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T=177.8×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

MCS（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.3556×ΔA

V反總：反應體系總體積，2.4×10^-4 L；ε：TNB摩爾消光系數，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500萬。

b.       使用96孔板測定的計算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

MCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1760×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

MCS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T=355.6×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

MCS（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.711×ΔA

V反總：反應體系總體積，2.4×10^-4 L；ε：TNB摩爾消光系數，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500萬。

配方：

試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存；（50mM Tris-HCl 7.4，8.56g 蔗糖，88mg EDTA）

試劑二：液體20mL×1瓶，4℃保存；(10mM Tris-HCl 7.4，1％Trixton-100)

試劑三：液體1.5mL×1支，4℃保存；(100mM PMSF)

試劑四：液體×1瓶，4℃保存；（稱0.135g Tris，0.166g KCl，8.4mgEDTA，溶于27.5mL雙蒸水，用HCl調pH至7.5）

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存；（稱取2mg DTNB，2mg 丙二酰CoA于30mL試劑瓶）

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；（稱取0.6mg草酰乙酸于1.5mLEP管）