磷脂酶C（ Phospholipases C，PLC ）試劑盒說(shuō)明書

 微量法100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

磷脂酶C（EC3.1.4.3）是一種水解甘油磷酸酯C3位點(diǎn)甘油磷酸酯鍵的脂類水解酶，廣泛存在于微生物及動(dòng)植物的組織和細(xì)胞中，在細(xì)胞代謝、細(xì)胞傳遞、生長(zhǎng)發(fā)育等方面具有重要作用。

測(cè)定原理：

磷脂酶C催化水解NPPC產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚，在410nm處有特征吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、研缽、超速冷凍離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體102mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體8mL×1瓶，4℃保存。

酶液提取：

1.        組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心5min，取全部上清于4℃、100000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。

2.        細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后于4℃，10000g離心5min，取全部上清于4℃、100000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。

3.        血清：直接測(cè)定。                  

測(cè)定操作：

酶活計(jì)算公式

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0191x - 0.0103，R² = 0.9991

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLC活性（nmol/min/mg prot）=（△A+0.0103）÷ 0.0191×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T = 17.45×（△A+0.0103）÷ Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克組織每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLC活性（nmol/min/g 鮮重）=（△A+0.0103）÷ 0.0191×V反總÷(V樣÷V樣總×W) ÷T

                          = 17.45×（△A+0.0103）÷ W

3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLC活性（nmol/min/10⁴ cell）=（△A+0.0103）÷ 0.0191×V反總÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量) ÷T

                          = 17.45×（△A+0.0103）÷ 細(xì)胞數(shù)量

4．按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLC活性（nmol/min/mL）= （△A+0.0103）÷ 0.0191×V反總÷V樣÷T

                       = 17.45×（△A+0.0103）

V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，30min

b.       用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0095x - 0.0103，R² = 0.9991

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLC活性（nmol/min/mg prot）=（△A+0.0103）÷ 0.0095×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T

                           = 35.09×（△A+0.0103）÷ Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克組織每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLC活性（nmol/min/g 鮮重）=（△A+0.0103）÷ 0.0095×V反總÷(V樣÷V樣總×W) ÷T

                          = 35.09×（△A+0.0103）÷ W

3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLC活性（nmol/min/10⁴ cell）=（△A+0.0103）÷ 0.0095×V反總÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量) ÷T

                    =35.09×（△A+0.0103）÷ 細(xì)胞數(shù)量

4．按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLC活性（nmol/min/mL）= （△A+0.0103）÷ 0.0095×V反總÷V樣÷T

                    = 35.09×（△A+0.0103）

V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，30min