NADH氧化酶（NADH oxidase，NOX）試劑盒說明書

                                      微量法 100管/96樣

注    意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

NOX（EC 1.6.99.3）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，可在氧氣存在下，直接將NADH氧化為NAD。該酶不僅參與NAD的再生，而且與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。

測(cè)定原理：

NOX能夠?qū)?/span>NADH氧化為NAD，NADH的氧化與2,6二氯酚靛藍(lán)（DCPIP）的還原相偶聯(lián)，藍(lán)色的DCPIP被還原為無色的DCPIP，在600nm下測(cè)定藍(lán)色DCPIP的還原速率計(jì)算出NADH氧化酶活性的大小。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水

試劑的組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：液體20mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：液體1.5mL×1瓶，-20℃保存；

試劑四：液體25mL×1瓶，4℃保存。

試劑五：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入5mL蒸餾水，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

①        準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

②        將勻漿600g，4℃離心5min。

③        棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11100g，4℃離心10min。

④        上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的NOX（此步可選做）。

⑤        步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），用于NOX活性測(cè)定。

血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至600nm，蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測(cè)定

（1）試劑四于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min。

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、200μL試劑四和40μL試劑五，混勻，記錄600nm處20s時(shí)吸光值A1和 1min20s后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

NOX活力單位的計(jì)算：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）NOX活力的計(jì)算:

單位的定義：每mL血清（漿）在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/mL）＝ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T=2500×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NOX活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T=505×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/10⁴ cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T=1.01×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.25mL； V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。

b. 使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

1、血清（漿）NOX活力的計(jì)算:

單位的定義：每mL血清（漿）在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/mL）＝ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T=5000×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NOX活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.005÷T=5000×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.005÷T=1010×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/10⁴ cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.005÷T=2.02×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.25mL； V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。