脯氨酸（PRO）含量測定試劑盒說明書

                                         微量法100管/96樣

注  意 ：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

Pro廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，逆境條件下，植物體內Pro含量顯著增加。Pro增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性強的品種往往積累較多的脯氨酸。因此，脯氨酸增加量可以作為抗逆育種的生理指標之一。

測定原理：

用磺基水楊酸（SA）提取Pro，加熱處理后，Pro與酸性茚三酮溶液反應生成紅色；加甲苯萃取后，在520nm測定吸光度。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、冰乙酸25mL、甲苯50mL、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：冰乙酸25 mL×1瓶， 4℃保存。（自備）

試劑二：液體25 mL×1瓶， 4℃保存。

試劑三：甲苯50mL×1瓶，4℃保存。（自備）

樣品測定的準備：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；之后置90℃振蕩提取10min；10000g，25℃離心10min，取上清，冷卻后待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿；之后置90℃振蕩提取10min；10000g，25℃離心10min，取上清，冷卻后待測。

2、血清（漿）樣品：按照血清（漿）體積（mL）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議取0.1mL血清（漿）加入1mL提取液），充分混勻，之后置90℃浴振蕩提取10分鐘，10000g，25℃離心10分鐘，取上清，冷卻后待測。

測定步驟：

1、   分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長至520nm，蒸餾水調零。

2、   樣本測定：

(1) 取0.25mL樣本+0.25mL試劑一+0.25mL試劑二 于有蓋EP管中，置沸水浴中保溫30min（蓋緊，防止水分散失），每10min振蕩一次。

(2) 待冷卻后，加入0.5mL試劑三，振蕩30s，靜置片刻，使色素轉至試劑三中；吸取0.2mL上層溶液于微量石英比色皿或96孔板中，于520nm波長處比色，記錄吸光值A。

Pro含量計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、典型回歸方程y = 0.0521x - 0.0021  (x為脯氨酸含量，μg/mL；y為吸光值A)

2、按照血清（漿）體積計算

Pro含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V3×V1÷V2）=192×(A+0.0021)

3、按照蛋白濃度計算

Pro含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V1×Cpr)=19.2×(A+0.0021)÷Cpr

4、按照樣本質量計算

Pro含量(µg/g鮮重)= [(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(W×V1÷V2)=19.2×(A+0.0021) ÷W

5、按照細菌或細胞密度計算

Pro含量(μg/10⁴ cell)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0384×(A+0.0021)

V1：加入反應體系中樣本體積，0.25mL；V2：加入提取液體積，1 mL；V3：加入血清（漿）體積，0.1 mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、典型回歸方程y = 0.02605x - 0.0021  (x為脯氨酸含量，μg/mL；y為吸光值A)

2、按照血清（漿）體積計算

Pro含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(V3×V1÷V2）=384×(A+0.0021)

3、按照蛋白濃度計算

Pro含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(V1×Cpr)=38.4×(A+0.0021)÷Cpr

4、按照樣本質量計算

Pro含量(µg/g鮮重)= [(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(W×V1÷V2)=38.4×(A+0.0021) ÷W

3、按照細菌或細胞密度計算

Pro含量(μg/10⁴ cell)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0769×(A+0.0021)

V1：加入反應體系中樣本體積，0.25mL；V2：加入提取液體積，1 mL；V3：加入血清（漿）體積，0.1 mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。

注意：Z低檢測限為1μg/mL。