魚類神經壞死病毒(VNN)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)

 【產品名稱】

商品名稱：魚類神經壞死病毒(VNN)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)

Name ：Viral Nervous Necrosis Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規格】50T/盒

【預期用途】

魚病毒性神經壞死病又稱為病毒性腦病和視網膜病，是一種嚴重危害魚類魚苗的病毒性疾病。病原為病毒性神經壞死病毒（Viral nervous necrosis virus, VNNV）,屬乙型野田村病毒屬成員[1]。其臨床癥狀為一系列與神經有關的異常表現。魚苗具不正常的螺旋狀或旋轉式游動或靜止時腹部朝上，一旦用手觸碰病魚，病魚會立即游動等現象，魚體體色異常蒼白。不同種類的魚臨床癥狀不同，有的魚苗會出現鰾過度膨脹，有的病魚厭食、消瘦等。發病嚴重的魚苗伴隨著ji高的死亡率[1-2]。

本試劑盒適用于檢測的魚的腦、眼等標本中魚類神經壞死病毒 RNA，適用于魚類神經壞死病毒感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒對魚類神經壞死病毒基因設計特異性的引物和探針[2-3]，用一步法熒光 RT-PCR 技術對魚類神經壞死病毒RNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

【試劑組成】

注：

1）  不同批號試劑不能混用。

2）  試劑盒內各試劑組份足夠包裝規格所標示的檢測次數。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列

熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

取魚類的腦和眼，魚苗和較小的仔魚取整條魚。

【保存和運輸】

上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標

本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1.  樣品處理（樣本處理區）

1.1  樣本前處理

每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中， 8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2  RNA 提取

推薦采用優利科（上海）生命科學有限公司生產的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），

請按照試劑盒說明書進行操作。

2.  試劑配制（試劑準備區）

根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數每滿 10 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。

3.  加樣（樣本處理區）

將步驟 1 提取的 RNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.  PCR 擴增（核酸擴增區）

4.1  將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；

4.2  設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；熒光通道選擇：

檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3  推薦循環參數設置：

5.  結果分析判定

5.1  結果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內調節)、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。

5.2  結果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數增長曲線；

可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤ 38，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測結果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

6.  質控標準

陰性質控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示；

陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

7.  檢測方法的局限性

? 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；

? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；

? 陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；

? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；

? 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；

? 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；

? 本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

? 所有操作嚴格按照說明書進行；

? 試劑盒內各種組分使用前應自然融化，wan全混勻并短暫離心；

? 反應液應避光保存；

? 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服；

? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；

? 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

? 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全   通則》進行處理。

【參考文獻】

[1] 陳愛平, 江育林, 錢冬, 等. 病毒性神經壞死病[J]. 中國水產, 2010.

[2] 中國農業部. SC/T 7216-2012 魚類病毒性神經壞死病(VNN)診斷技術規程[S]. [3]羅衛. 魚類病毒性神經壞死病的病原學研究及檢測方法的建立[J]. 華中農業大學, 2007.